口腔疾病防治 ›› 2018, Vol. 26 ›› Issue (2): 83–89.doi: 10.12016/j.issn.2096-1456.2018.02.003

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口腔鳞状细胞癌组织中环状RNA的差异表达谱分析

赵思语1(), 欧阳少波1, 王军2, 黄自坤3, 罗清3, 廖岚1()   

  1. 1. 南昌大学附属口腔医院修复科, 江西省口腔生物医学重点实验室, 江西 南昌(330006)
    2. 南昌大学第二附属医院口腔颌面外科, 江西 南昌(330006)
    3. 南昌大学第一附属医院检验科, 江西 南昌(330006)
  • 收稿日期:2017-12-06 修回日期:2017-12-15 出版日期:2018-02-20 发布日期:2018-08-31
  • 作者简介:

    【作者简介】 赵思语,医师,硕士研究生在读, Email: 531909402@qq.com

    【通信作者简介】 廖岚,教授,主任医师,博士生导师。现任南昌大学附属口腔医院党委书记,《口腔疾病防治》杂志副主编。江西省百千万人才、江西省巾帼建功标兵、江西省高等学校中青年骨干教师、江西省卫生系统学术和技术带头人培养对象、江西省医学领先学科成员。中华口腔医学会第一届口腔科研管理分会委员、江西省口腔医师分会常委、江西省医学科普学会常委、江西省口腔医学会理事、江西省口腔修复专委会副主任委员、江西省研究型医院学会第一届科研管理和学科建设分会副主任委员、江西省口腔医学会口腔医学教育专委会主任委员、江西省研究型医院口腔分会主任委员。主要研究方向:口腔疾病基础与临床、口腔生物材料。主持国家自然科学基金及省部级科研项目10余项。发表专业学术论文20余篇,其中SCI源刊物6篇,参编专著3部。

  • 基金资助:
    国家自然科学基金项目(81660444);江西省自然科学基金项目(20171BAB205050);江西省重点研发计划项目(20161BBG70149);江西省卫生和计生委科技项目(20175296)

Differential expression of circular RNA in oral squamous cell carcinoma

Siyu ZHAO1(), Shaobo OUYANG1, Jun WANG2, Zikun HUANG3, Qing LUO3, Lan LIAO1()   

  1. 1.Department of Oral Prosthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University, the Key Laboratory of Oral Biomedicine in Jiangxi Provinice, Nanchang 330006, China
    2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
    3. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
  • Received:2017-12-06 Revised:2017-12-15 Online:2018-02-20 Published:2018-08-31

摘要:

目的 分析环状RNA(circular RNA,circRNA)在口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织中表达谱的差异及临床意义。方法 利用高通量芯片技术检测3例口腔鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织中的差异表达circRNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)方法验证所筛选的部分circRNA分子在45对口腔鳞状细胞癌组织与癌旁组织中的表达情况。分析上调明显的circRNA表达水平与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系,采用Arraystar公司circRNA靶基因分析软件,预测可能与上调明显的circRNA相互作用的靶miRNA分子。结果 口腔鳞状细胞癌患者癌组织与癌旁组织样本间差异表达的circRNA共155个,其中上调45个,下调110个。所挑选的在口腔鳞状细胞癌组织上调或下调差异表达最显著的3条circRNA中RT-qPCR验证结果显示,与癌旁组织相比,口腔鳞癌癌组织中hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971、has_circ_0067934表达上调,hsa_circ_0000520、hsa_circ_0023944、hsa_circ_0000140表达下调,与芯片检测结果一致。在上述芯片筛选的口腔鳞状细胞癌组织特征circRNA表达谱中,hsa_circ_0001874上调表达最明显,hsa_circ_0001874的表达在不同临床分期及细胞分化程度存在显著差异;circRNA靶基因分析软件预测结果提示,miR-103a-3p、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的潜在靶基因。结论 多种circRNA在口腔鳞状细胞癌组织中呈异常表达,这些表达差异的circRNA及其潜在的靶基因可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展密切相关。

关键词: 环状RNA, 口腔, 鳞状细胞, 癌, 癌旁组织, 基因芯片, RT-qPCR, 靶基因

Abstract:

Objective To analyze circular RNA (circRNA) expression profiles in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and its clinical significance. Methods The expression of circRNA was detected with circRNA microarray assay in three samples of OSCC tumor and matched adjacent tissues. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to verify the expression of circRNA in 45 pair OSCC tissues and normal adjacent tissues. The relationship between the expression of circRNA and the clinicopathological characteristics of OSCC was analyzed. circRNAs/miRNAs interaction were predicted using Arraystar' s home-made miRNA target prediction software. Results 155 circRNAs were differentially expressed between the OSCC tissues and matched adjacent tissues, of which 45 circRNAs were up-regulated and 110 circRNAs were down-regulated in OSCC tissues (fold changes ≥1.5 and P < 0.05). In the selected three circRNAs that were most significantly upregulated or downregulated in OSCC, the RT-qPCR results showed that hsa_circ_0001874, hsa_circ_0001971 and has_circ_0067934 were increased, while hsa_circ_0000520, hsa_circ_0023944 and hsa_circ_0000140 were decreased in OSCC tissues versus normal adjacent tissues (P < 0.001). The results were generally consistent with the microarray data. Among the circRNA expression profiles in OSCC, the up-regulation of hsa_circ_0001874 was the highest and the expression of hsa_circ_0001874 was significantly correlated with TNM stage and tumor grade. The result of Arraystar' s home-made miRNA target prediction software indicated that miR-103a-3p, miR-107, miR-593-5p, miR-661 and miR-662 may be potential target genes of hsa_circ_0001874. Conclusion The differentially expressed circRNAs in OSCC tissues and normal adjacent tissues were identified, and these dysregulated circRNAs and their potential target gents may play important roles in the development of OSCC.

Key words: Circular RNA, Oral, Squamous cell, Carcinoma, Matched adjacent tissues, Microarray, Quantitative real-time PCR, Target genes

中图分类号: 

  • R739.8

表1

RT-qPCR引物序列"

引物名称 序列(5′-3′) 片段长度
(bp)
β-actin 上游:CATGTACGTTGCTATCCAGGG 250
下游:CTCCTTAATGTCACGCACGAT
hsa_circ_0001874 上游:TTGGCTCTCCTGCTGTGC 122
下游:GGTCATCCACAATCAGCCCA
hsa_circ_0001971 上游:GCTGCCTTAACTTACATGCCC 158
下游:ACTTTGTGGCTCCTGGATAACT
has_circ_0067934 上游:TAGCAGTTCCCCAATCCTTG 135
下游:CACAAATTCCCATCATTCCC
hsa_circ_0000520 上游:GGAAGGTCTGAGACTAGGGCCA 122
下游:AAGGGACATGGGAGTGGAGTG
hsa_circ_0023944 上游:AATAGTAGTTGGGTGGTGGTCT 120
下游:CTGCCAACTGTGGGATGTTC
hsa_circ_0000140 上游:CCGGCATTACCTACTGGAGTC 161
下游:CCTTCCACCTTCTCCTTGACA

表2

总RNA和合成标记cRNA的质控"

样本 总RNA cRNA
OD260/280
比值
OD260/230
比值
浓度
(ng/μL)
体积
(μL)
总量
(ng)
cRNA浓度
(μg/μL)
Cy3标记特异活性
(pmol Cy3/μg)
体积
(μL)
总量
(μg)
T1 1.87 2.21 1 092.80 50 54 640.00 0.432 6 32.91 10 4.33
T2 1.96 2.16 1 134.67 50 56 734.00 0.485 1 32.14 10 4.85
T3 1.85 2.22 1 066.94 50 53 347.00 0.454 3 29.80 10 4.54
N1 1.94 2.13 993.61 50 49 680.50 0.518 0 28.73 10 5.18
N2 1.86 2.20 1 391.44 50 55 657.60 0.568 1 26.54 10 5.68
N3 1.92 2.06 1 360.94 50 54 437.60 0.454 7 29.99 10 4.55

表3

口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织相比有显著上调的前15个circRNA"

circRNA 上调倍数 circRNA类型 染色体定位 基因定位
hsa_circ_0001874 6.2251323 intronic chr9 BICD2
hsa_circ_0001971 5.0196834 exonic chr7 FAM126A
has_circ_0067934 4.6755761 exonic chr3 PRKCI
hsa_circ_0009910 4.3988596 exonic chr1 MFN2
hsa_circ_0000069 4.2901026 exonic chr1 STIL
hsa_circ_0008068 4.0083441 exonic chr13 KATNAL1
hsa_circ_0008609 3.9761604 exonic chr2 MRPL30
hsa_circ_0001221 3.8211575 intronic chr22 SEC14L6
hsa_circ_0000284 3.2614234 exonic Chr11 HIPK3
hsa_circ_0001772 3.0316954 exonic chr7 RBM33
hsa_circ_0009541 2.9467732 exonic chr1 CAMTA1
hsa_circ_0000711 2.9083351 exonic chr16 NFATC3
hsa_circ_0000272 2.7267515 sense overlapping chr11 MOB2
hsa_circ_0003258 2.6864864 exonic chr17 ZNF652
hsa_circ_0000685 2.6704982 intronic chr16 BOLA2

表4

口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织相比有显著下调的前15个circRNA"

circRNA 下调倍数 circRNA类型 染色体定位 基因定位
hsa_circ_0000520 8.1739243 sense overlapping chr14 RPPH1
hsa_circ_0023944 7.5087552 exonic chr11 PICALM
hsa_circ_0000140 6.3588978 exonic chr1 KIAA0907
hsa_circ_0001649 5.5033948 exonic chr6 SHPRH
hsa_circ_0003570 4.4506524 exonic chr10 FAM53B
hsa_circ_0002632 4.0537517 exonic chr1 STIL
hsa_circ_0000708 3.6528857 intronic chr16 FAM65A
hsa_circ_0004968 3.5888536 exonic chr3 DCBLD2
hsa_circ_0007158 3.4608936 exonic chr5 FAM169A
hsa_circ_0001638 3.3768596 exonic chr6 KIAA1919
hsa_circ_0006570 3.2942557 exonic chr9 C9orf129
hsa_circ_0008792 3.1611478 exonic chr9 PAPPA
hsa_circ_0003645 3.1408427 exonic chr16 C16orf62
hsa_circ_0002074 3.0570988 exonic chr3 TAMM41
hsa_circ_0000191 3.0266706 intronic chr1 PSEN2

图1

口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织之间差异表达的circRNA a: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织circRNA芯片聚类分析图,T1~T3为口腔鳞状细胞癌组织,N1~N3为癌旁对照组织; b: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织circRNA表达强度箱形图; c: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织差异表达circRNA散点图,T为口腔鳞状细胞癌组织,N为癌旁对照组织。"

表5

RT-qPCR检测差异性表达的circRNA表达量"

组别 hsa_circ_0001874 hsa_circ_0001971 has_circ_0067934 hsa_circ_0000520 hsa_circ_0023944 hsa_circ_0000140
口腔鳞状细胞癌 4.92 ± 2.10 4.35 ± 1.46 3.82 ± 1.23 0.12 ± 0.04 0.27 ± 0.09 0.39 ± 0.08
癌旁配对组织 1.12 ± 0.53 1.07 ± 0.49 1.17 ± 0.40 1.03 ± 0.35 1.09 ± 0.28 1.01 ± 0.25
t 11.36 9.54 7.21 -6.14 -5.23 -4.79
P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001

图2

Hsa_circ_0001874与miRNAs相互作用位点的详细注释图"

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