低氧激活HIF-1α 抑制人牙周膜成纤维细胞的成骨分化
庞静雯1, 吴亚霖1, 徐婷1, 庄秀妹2
1. 广州市海珠区口腔医院,广东广州(510220)
2.中山大学附属孙逸仙纪念医院口腔科,广东广州(510120)
通讯作者:庄秀妹,主治医师,硕士,Email:zxmsysu@163.com

作者简介:庞静雯,主治医师,硕士,Email:pjwlj@126.com

摘要

目的 探讨低氧环境对人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)成骨分化的影响,以及低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)在该过程中的作用。方法 组织块法原代分离牙周膜标本中PDLCs,采用激光共聚焦检测波形蛋白与细胞角蛋白表达。PDLCs分别在常氧(20%体积分数O2)培养以及低氧(1%体积分数O2)培养12~72 h,检测常氧组与低氧组PDLCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性,比较成骨标志物ALP、I型胶原(Collogen-1, COL1)、成骨特异性转录因子(runt related transcription factor 2, RUNX2)的mRNA表达量变化,Western免疫印迹检测HIF-1α表达水平。进一步转染小干扰RNA(HIF-1α-siRNA 1, 2),检测低氧环境中PDLCs的HIF-1α水平、ALP活性与成骨标志物mRNA表达变化。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果 组织块法成功获取PDLCs,PDLCs中波形蛋白阳性表达、细胞角蛋白阴性表达。低氧环境中培养48 h后PDLCs中ALP活性下降,ALP、COL1、RUNX2的mRNA表达量显著降低,但HIF-1α蛋白表达升高。HIF-1α-siRNA成功敲低PDLCs中HIF-1α表达,敲低HIF-1α的PDLCs在低氧环境中的ALP活性升高,ALP、COL1、RUNX2的mRNA表达量增加。结论 长时间低氧处理能抑制PDLCs成骨分化,敲低HIF-1α表达可逆转低氧对PDLCs成骨分化的抑制作用。

关键词: 牙周炎; 人牙周膜成纤维细胞; 低氧; 成骨分化; 低氧诱导因子-1α
中图分类号:R781.4 文献标志码:A 文章编号:2096-1456(2017)08-0488-06
Effects of hypoxic condition on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells via hypoxia inducible factor-1α
PANG Jingwen1, WU Yalin1, XU Ting1, ZHUANG Xiumei2
1. Guangzhou Haizhu District Hospital of Stomatology, Guangzhou 510220, China
2. Department of Stomatology, Sun Yat-sen Memorial Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, China
Corresponding author: ZHUANG Xiumei, Email: zxmsysu@163.com, Tel: 0086-20-34071070
Abstract

Objective To investigate the effects of hypoxia on osteogenic differentiation of periodontal ligament cells (PDLCs) and the role of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) in this process.Methods Human PDLCs were isolated and identified by checking the expression of vimentin and cytokeratin. PDLCs were cultured in normoxia (20% O2) or hypoxia (1% O2) for 12-72 h. Changes of alkaline phosphatase (ALP) activity and mRNA expressions of osteogenic markers ALP, collagen-I (COL1) and runt related transcription factor 2 (RUNX2) were detected. Western blot was used to detect the expression of HIF-1α. After transfected with HIF1α-siRNA, the expressions of HIF-1αand osteogenic differentiation markers were furthered detected. The statistics were analyzed with SPSS13.0.Results Positive vimentin but negative cytokeratin were observed in primary cultured PDLCs. ALP activity and mRNA expressions of ALP, COL1 and RUNX2 were decreased in PDLCs in hypoxia for 48 h, while HIF-1α expression was increased. After knocking down of HIF-1α with siRNA, HIF-1α was significantly reduced in PDLCs under hypoxia, while ALP activity and mRNA expressions of osteogenic markers were significantly increased.Conclusion Hypoxia may inhibit osteogenic differentiation of PDLCs via upregulated HIF-1α.

Keyword: Periodontitis; Periodontal ligament cells; Hypoxia; Osteogenic differentiation; Hypoxia inducible factor-1α

牙周炎是一类常见的严重危害人类口腔健康的慢性感染性疾病, 主要表现为牙周袋形成和牙槽骨吸收, 是我国成人牙齿松动与缺失的主要原因[1]。牙周组织再生一直是牙周病研究的重点, 其中具有多向分化能力的牙周膜细胞, 特别是牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)成骨矿化过程中分子调控机制的研究非常重要[2]

厌氧菌、咬合、吸烟以及牙周炎症本身都可以降低牙周组织的局部氧张力, 使之处于相对缺血和低氧状态[3]。氯化钴化学模拟的低氧状态已被证实能抑制人PDLCs成骨分化[4]。低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α , HIF-1α )作为最主要的低氧应答调控因子, 在调节氧诱导的基因表达中具有关键作用[5]。牙周炎患者的牙周组织中HIF-1α 表达水平相较于正常人显著升高, 提示低氧在牙周炎发生进展过程中可能具有重要作用[6]。目前, 低氧是否通过HIF-1α 调控PDLCs的成骨分化尚不明确。因此, 本研究利用低氧培养箱培养的方法比较常氧(体积分数为20% O2)和低氧(体积分数为1% O2)环境对PDLCs成骨分化的影响, 通过小干扰RNA敲低技术探讨HIF-1α 在该过程中的作用。

1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器

胰酶、胎牛血清、DMEM培养基(Gibco, 美国); 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所); 小鼠抗人HIF-1α 、波形蛋白、GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠二抗(Proteintech, 美国); 小鼠抗人细胞角蛋白抗体(北京中杉金桥有限公司); 反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Takara, 日本); CO2细胞培养箱(体积分数为5% CO2、20% O2)与低氧细胞培养箱(体积分数为5% CO2、1% O2)。

1.2 PDLCs的原代培养

选择15~22岁患者因正畸需要拔除的前磨牙13例, 拔出时牙根完整, 且无牙周、牙体、牙髓、根尖病变, 本研究经中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会批准并获得所有患者知情同意(2016伦备第84号)。具体方法如下:去除根端血迹, 刮取根中1/3牙周膜组织, 采用组织块法以含20%质量分数胎牛血清、1∶ 100双抗的DMEM培养基原代培养PDLCs。约第6天细胞生长达80%, 胰酶消化传代, 后继续于含10%质量分数的胎牛血清、1∶ 100双抗的DMEM培养基中培养, 取前5代PDLCs用于实验。

1.3 细胞免疫荧光实验

将细胞接种于腔室玻片上过夜, 4%的多聚甲醛固定15 min, 0.1%的triton X-100透化10 min, 1%质量分数的牛血清白蛋白封闭60 min, 分别加入一抗波形蛋白和细胞角蛋白于4 ℃孵育过夜, 之后转入FITC标记的二抗室温孵育1 h, 0.5 μ g/mL DAPI室温染核2 min, 抗荧光淬灭剂封片, 共聚焦荧光显微镜(Zeiss, 德国)拍片。

1.4 ALP活性检测

将PDLCs以2 × 104个/孔接种于24孔板中, 按实验分组置于常氧(20%体积分数O2)或低氧(1% O2体积分数)培养箱培养, PBS清洗后根据试剂说明加细胞裂解液200 μ L, 4 ℃冰箱过夜。取出培养板, 振荡10 min使细胞破碎制成悬液, 每孔取30 μ L转入96孔板后加入50 μ L缓冲液及基质液, 37 ℃恒温水浴15 min, 加入150 μ L显色剂, 酶标仪520 nm波长下测定ALP吸光度值。

1.5 Western免疫印迹

按分组收集经低氧、siRNA处理PDLCs的裂解蛋白进行抽提并定量。取等量总蛋白于沸水中煮7 min, 8% SDS-PAGE电泳分离后, 将凝胶上的蛋白转至PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉封闭2 h, 分别加入一抗4 ℃孵育过夜, 之后转入HRP标记的二抗室温孵育2 h, ECL化学发光显影扫描。

1.6 实时定量PCR

收集的细胞用Trizol法裂解细胞, 提取总RNA, 紫外分光光度计测量RNA含量。取1 μ g RNA合成cDNA, 按Takara公司Quant SYBR Green PCR kit试剂操作说明进行扩增。应用Primer Premier 5.0软件设计Real-time PCR引物, ALP引物序列为:Forward 5′ -TCAAACCGAGATACAAGCAC-3′ , Reverse 5′ -CCACCAGCAAGAAGAAGC-3′ ; I型胶原(collagen-I, COL1)引物序列为:Forward 5′ -TCCAACGAGATCGAGATCC-3′ , Reverse 5′ -AAGCCGAATTCCTGGTCT-3′ ; 成骨特异性转录因子(runt related transcription factor 2, RUNX2)引物序列为:Forward 5′ -GCCTTCAAGGTGGTAGCCC-3′ , Reverse 5′ -CGTTACCCGCCATGACAGTA-3′ ; 内参GAPDH序列为:Forward 5′ -ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′ , Reverse 5′ -CTGGACTGGACGGCAGATCT-3′ 。按公式计算求得各样品基因相对表达量。对照组基因相对表达量为1。

1.7 细胞转染

HIF1α -siRNA、NC-siRNA均购自上海吉玛生物科技公司, HIF-1α -Si1靶序列为5′ -CTGATGACCAGCAACTTGA-3′ , HIF-1α -Si2靶序列为:5′ -GGAAATGAGAGAAATGCTTAC-3′ , NC-siRNA靶序列为:5′ -AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′ 。

根据说明在六孔板中使用Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent将HIF1α -siRNA转染至PDLCs, 此时细胞密度为30%~50%, siRNA终浓度为50 nmol/L。同时设计阴性对照siRNA为NC-Si组与空白对照Mock组, 培养48 h, 提取蛋白后检测各组细胞中HIF-1α 表达以验证转染效率, 进一步裂解细胞、提取RNA以进行后续研究。

1.8 统计学处理

数据以 x̅± s表示。各实验至少重复3次, 采用SPSS 13.0软件包分析结果。对两组实验数据进行校正t检验, 多组比较采用单因素方差分析, P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 原代PDLCs的鉴定

本研究应用组织块法成功地从因正畸需要拔除的前磨牙牙周膜标本中获取原代PDLCs, 5~7 d镜下可见梭形的牙周膜细胞从组织块周围爬出, 大约14 d细胞可达80%融合。光学显微镜下显示PDLCs呈长梭形, 可见少量胞浆突起(图1a)。为进一步排除其上皮细胞来源并鉴定其间质属性, 我们进行了波形蛋白、细胞角蛋白免疫荧光染色, 发现PDLCs阳性表达波形蛋白, 同时阴性表达细胞角蛋白(图1b、c), 说明本研究中获取的PDLCs完全是间质来源, 而没有上皮细胞污染。

图1 PDLCs的形态学特点及免疫荧光Figure 1 Phase-contrast micrograph and immunofluorescence staining of primary cultured PDLCs

2.2 低氧抑制PDLCs成骨分化

分别收集常氧、低氧环境中培养的PDLCs进行ALP活性检测, 结果显示:相比常氧组, PDLCs在低氧中培养12 h与24 h后ALP活性略有升高, 然而差异无统计学意义(12 h组:t=0.718, P=0.512; 24 h组:t=0.391, P=0.716)。继续培养至48 h和72 h, 低氧组PDLCs中ALP活性较常氧组下降显著, 差异具有统计学意义(48 h组:t=2.926, P=0.043; 72 h组:t=6.928, P=0.002)。

进一步比较常氧和低氧环境中PDLCs培养48 h后成骨标志物mRNA表达, 结果显示:相比常氧组, PDLCs在低氧环境中培养48 h后成骨标志物ALP、COL1、RUNX2的表达量分别降低67.23%(t=8.119, P=0.001)、83.00%(t=9.605, P< 0.001)与85.27%(t=11.060, P< 0.001), 差异具有统计学意义。

2.3 低氧促进PDLCs中HIF-1α 表达

进一步探讨低氧抑制PDLCs成骨分化的可能机制, Western blotting证实相较于常氧组的HIF-1α /GAPDH蛋白比值0.34 ± 0.06, PDLCs在低氧环境中培养12 h、24 h与48 h后蛋白比值显著上调, 分别为0.74 ± 0.06(t=4.991, P=0.008)、0.76 ± 0.05(t=5.396, P=0.006)与0.78 ± 0.04(t=6.067, P=0.004), 差异具有统计学意义。

图2 低氧对人PDLCs细胞成骨分化的影响Figure 2 Effects of hypoxia on osteogenic differentiation of PDLCs

图3 PDLCs在低氧下HIF-1α 蛋白变化Figure 3 Expressions of HIF-1α in PDLCs under hypoxia

2.4 敲低HIF-1α 表达可逆转低氧对PDLCs成骨分化的抑制作用

为了进一步证实HIF-1α 在低氧抑制PDLCs成骨分化中的重要作用, 通过小干扰RNA(siRNA)转染HIF1α -siRNA, 使PDLCs中HIF-1α 表达降低。Western免疫印迹证实HIF1α -Si1、Si2转染组PDLCs相比于阴性对照NC-Si组PDLCs的HIF-1α 表达量分别下降49.19%(t=4.674, P=0.010)与51.10%(t=5.268, P=0.006)(图3b)。

将各组细胞继续在低氧培养箱中培养48 h, HIF1α -Si1、Si2组中PDLCs的ALP活性是NC-Si组的1.35倍(t=3.315, P=0.029)与1.37倍(t=4.033, P=0.016), 差异具有统计学意义(图4a)。比较各组PDLCs成骨标志物mRNA的表达变化, 发现HIF1α -Si1、Si2组中PDLCs的ALP分别是NC-Si组的2.60倍(t=6.590, P=0.003)与2.46倍(t=7.717, P=0.002), COL1分别是NC-Si组的4.50倍(t=12.06, P< 0.001)与4.51倍(t=19.13, P< 0.001), RUNX2分别是NC-Si组的3.84倍(t=15.34, P< 0.001)与3.74倍(t=13.12, P< 0.001), 差异具有统计学意义(图4b)。

图4 敲低HIF1α 表达后低氧对PDLCs细胞成骨分化的影响Figure 4 Effect of hypoxia on osteogenic differentiation of PDLCs treated with HIF1α -siRNA

3 讨 论

PDLCs是牙周结缔组织的主要间质细胞, 参与合成大量细胞外基质蛋白和胶原纤维[7]。作为一类具有多向分化潜能的细胞, PDLC可以分化为成骨样细胞和成牙本质样细胞并参与组织的修复与再生, 是牙周组织再生的重要种子细胞[8]。本实验成功培养了PDLCs, 免疫荧光染色结果显示细胞抗角蛋白阴性、抗波形蛋白阳性, 确认细胞为中胚层来源, 符合PDLCs特征。

骨再生对牙周病的治疗意义重大, 在牙周组织的稳固中起重要作用。PDLCs骨向分化是一个长期的成骨过程, 是牙周骨再生研究中的重点[9]。目前许多研究主要探讨低氧对PDLCs增殖凋亡的影响[10]。然而, PDLCs的骨向分化在牙周骨再生过程中意义重大, 成骨标志物的确定是研究PDLCs成骨分化的基础。ALP是成骨分化活性的重要标志物; RUNX2作为骨向分化特异转录因子, 参与激活和启动成骨细胞系分化与成熟, 促进细胞外基质蛋白COL1、OCN等合成与表达; 而COL1是骨组织有机质的主要成分, 成骨分化阶段分泌大量COL1可以稳定细胞外基质、形成类骨质, 为矿化做准备[3]。目前, 关于低氧对PDLCs成骨分化影响的报道甚少, Wu等[11]研究发现, 短时间(24 h内)低氧可以促进PDLCs的ALP活性; Zhao等[12]也证实, 短时间低氧促进牙周膜干细胞ALP、RUNX2表达, 说明低氧可以诱导PDLCs成骨分化。然而, Zhang等[3]研究发现长时间低氧对PDLCs的ALP活性主要起抑制作用, 并具有时间和低氧程度依赖性。本研究中PDLCs在低氧环境中培养12、24 h的ALP活性比常氧组略有升高, 说明短时间低氧刺激可能促进PDLCs成骨分化, 但差异无统计学意义。继续在低氧环境中培养至48 h和72 h, PDLCs的ALP活性较常氧组下降明显, 同时成骨标志物ALP、COL1、RUNX2的表达量显著下降, 说明随着低氧诱导时间的延长, PDLCs成骨分化能力逐渐降低, 据此我们推测长时间低氧的牙周微环境是导致慢性牙周炎进展的重要原因。

HIF-1α 是一个广泛存在于哺乳动物细胞内的低氧应答调控因子, 可通过调节氧诱导基因的表达维持低氧下细胞存活和组织中的氧稳态, 是目前研究低氧与组织愈合及再生关系的热点之一[13]。然而, 在不同细胞以及不同实验条件下, HIF-1α 在细胞分化过程中表现出截然相反的作用, 特别在严重或长时间低氧时, HIF-1α 可抑制促成骨分化基因的表达[14]。据此, 笔者查阅文献发现, HIF-1α 可以促进血管内皮生长因子、促血管生成素和基质细胞衍生因子-1等血管生成基因的表达, 导致低氧环境中血管的大量生成, 这在一定程度上可以改善低氧区域的血供和氧供给, 维持细胞存活和组织氧稳态[11]。然而, 持续极度低氧下HIF-1α 可诱导非典型性BNIP3/BNIP3L(NIX)和mTOR信号通路进而介导细胞发生自噬, 抑制细胞的增殖与分化[15]。这提示低氧时间与强度是影响HIF-1α 不同生物学功能的重要原因, 本研究也发现12 h、24 h低氧刺激可能促进PDLCs成骨分化, 而48 h、72 h低氧刺激抑制成骨分化。Watanabe等[13]也发现HIF-1α 介导转化生长因子-β 1(TGFβ 1)诱导PDLCs中COL1表达, 说明HIF-1α 可能参与PDLCs的成骨分化。本研究证实长时间低氧环境抑制PDLCs成骨分化的同时伴随着HIF-1α 表达上升, 小干扰RNA敲低HIF-1α 表达可促进PDLCs中ALP活性和成骨标志物ALP、COL1、RUNX2表达, 逆转低氧对PDLCs成骨分化的抑制作用, 从正反两个方面说明了长时间低氧环境激活的HIF-1α 对PDLCs成骨分化的抑制作用。

综上所述, 本研究证实长时间的低氧环境能抑制PDLCs成骨分化, 敲低HIF-1α 表达是逆转低氧抑制PDLCs成骨分化的关键。牙周低氧微环境促进牙周炎进展, HIF-1α 是低氧影响牙周组织的重要调控因子, 如何克服牙周局部低氧环境以及针对HIF-1α 的靶向药物研制将是今后研究的重点。

The authors have declared that no competing interests exist.

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