口腔鳞状细胞癌组织中环状RNA的差异表达谱分析
赵思语1, 欧阳少波1, 王军2, 黄自坤3, 罗清3, 廖岚1
1. 南昌大学附属口腔医院修复科, 江西省口腔生物医学重点实验室, 江西 南昌(330006)
2. 南昌大学第二附属医院口腔颌面外科, 江西 南昌(330006)
3. 南昌大学第一附属医院检验科, 江西 南昌(330006)
【通信作者】 廖岚,主任医师,博士生导师, Email: liaolan5106@163.com

【作者简介】 赵思语,医师,硕士研究生在读, Email: 531909402@qq.com

【通信作者简介】 廖岚,教授,主任医师,博士生导师。现任南昌大学附属口腔医院党委书记,《口腔疾病防治》杂志副主编。江西省百千万人才、江西省巾帼建功标兵、江西省高等学校中青年骨干教师、江西省卫生系统学术和技术带头人培养对象、江西省医学领先学科成员。中华口腔医学会第一届口腔科研管理分会委员、江西省口腔医师分会常委、江西省医学科普学会常委、江西省口腔医学会理事、江西省口腔修复专委会副主任委员、江西省研究型医院学会第一届科研管理和学科建设分会副主任委员、江西省口腔医学会口腔医学教育专委会主任委员、江西省研究型医院口腔分会主任委员。主要研究方向:口腔疾病基础与临床、口腔生物材料。主持国家自然科学基金及省部级科研项目10余项。发表专业学术论文20余篇,其中SCI源刊物6篇,参编专著3部。

摘要

目的 分析环状RNA(circular RNA,circRNA)在口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织中表达谱的差异及临床意义。方法 利用高通量芯片技术检测3例口腔鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织中的差异表达circRNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)方法验证所筛选的部分circRNA分子在45对口腔鳞状细胞癌组织与癌旁组织中的表达情况。分析上调明显的circRNA表达水平与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系,采用Arraystar公司circRNA靶基因分析软件,预测可能与上调明显的circRNA相互作用的靶miRNA分子。结果 口腔鳞状细胞癌患者癌组织与癌旁组织样本间差异表达的circRNA共155个,其中上调45个,下调110个。所挑选的在口腔鳞状细胞癌组织上调或下调差异表达最显著的3条circRNA中RT-qPCR验证结果显示,与癌旁组织相比,口腔鳞癌癌组织中hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971、has_circ_0067934表达上调,hsa_circ_0000520、hsa_circ_0023944、hsa_circ_0000140表达下调,与芯片检测结果一致。在上述芯片筛选的口腔鳞状细胞癌组织特征circRNA表达谱中,hsa_circ_0001874上调表达最明显,hsa_circ_0001874的表达在不同临床分期及细胞分化程度存在显著差异;circRNA靶基因分析软件预测结果提示,miR-103a-3p、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的潜在靶基因。结论 多种circRNA在口腔鳞状细胞癌组织中呈异常表达,这些表达差异的circRNA及其潜在的靶基因可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展密切相关。

关键词: 环状RNA; 口腔; 鳞状细胞; ; 癌旁组织; 基因芯片; RT-qPCR; 靶基因
中图分类号:R739.8 文献标志码:A 文章编号:2096-1456(2018)02-0083-07
Differential expression of circular RNA in oral squamous cell carcinoma
ZHAO Siyu1, OUYANG Shaobo1, WANG Jun2, HUANG Zikun3, LUO Qing3, LIAO Lan1
1.Department of Oral Prosthodontics, Affiliated Stomatological Hospital of Nanchang University, the Key Laboratory of Oral Biomedicine in Jiangxi Provinice, Nanchang 330006, China
2. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
3. Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China
Corresponding author: LIAO Lan, Email: liaolan5106@163.com, Tel: 0086-791-86235863
Abstract

Objective To analyze circular RNA (circRNA) expression profiles in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and its clinical significance.Methods The expression of circRNA was detected with circRNA microarray assay in three samples of OSCC tumor and matched adjacent tissues. Quantitative real-time PCR (RT-qPCR) was used to verify the expression of circRNA in 45 pair OSCC tissues and normal adjacent tissues. The relationship between the expression of circRNA and the clinicopathological characteristics of OSCC was analyzed. circRNAs/miRNAs interaction were predicted using Arraystar' s home-made miRNA target prediction software.Results 155 circRNAs were differentially expressed between the OSCC tissues and matched adjacent tissues, of which 45 circRNAs were up-regulated and 110 circRNAs were down-regulated in OSCC tissues (fold changes ≥1.5 and P < 0.05). In the selected three circRNAs that were most significantly upregulated or downregulated in OSCC, the RT-qPCR results showed that hsa_circ_0001874, hsa_circ_0001971 and has_circ_0067934 were increased, while hsa_circ_0000520, hsa_circ_0023944 and hsa_circ_0000140 were decreased in OSCC tissues versus normal adjacent tissues ( P< 0.001). The results were generally consistent with the microarray data. Among the circRNA expression profiles in OSCC, the up-regulation of hsa_circ_0001874 was the highest and the expression of hsa_circ_0001874 was significantly correlated with TNM stage and tumor grade. The result of Arraystar' s home-made miRNA target prediction software indicated that miR-103a-3p, miR-107, miR-593-5p, miR-661 and miR-662 may be potential target genes of hsa_circ_0001874.Conclusion The differentially expressed circRNAs in OSCC tissues and normal adjacent tissues were identified, and these dysregulated circRNAs and their potential target gents may play important roles in the development of OSCC.

Keyword: Circular RNA; Oral; Squamous cell; Carcinoma; Matched adjacent tissues; Microarray; Quantitative real-time PCR; Target genes

口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率在全球呈逐年上升趋势[1]。因其易发生淋巴结转移且预后差等特点, 5年整体生存率仅约为50% [2]。目前认为, 口腔鳞状细胞癌的病因复杂多样, 包括吸烟在内的环境因素及遗传等内在因素均可造成口腔鳞状细胞癌的发生发展, 但其确切发病机制尚不明确[3]。环状RNA(circular RNA, circRNA)是一类具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子, 主要分布于细胞质中, 序列高度保守, 在哺乳动物大量并稳定存在, 具有一定的组织、时序和疾病特异性, 在蛋白质合成、基因表达以及转录后修饰等细胞生物学功能中发挥重要的调节作用[4]。越来越多的证据表明, circRNA的异常表达与肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关[5, 6, 7]。目前, circRNA在口腔鳞状细胞癌中的研究刚起步。为了更好了解circRNA在口腔鳞状细胞癌中的表达情况, 本研究利用高通量芯片技术检测3例口腔鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织中的差异表达circRNA, 采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)方法验证所筛选的部分circRNA分子在45对口腔鳞状细胞癌组织与癌旁组织中的表达情况。分析上调明显的circRNA表达水平与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系, 采用circRNA靶基因分析软件, 预测可能与上调明显的circRNA相互作用的靶miRNA分子, 为研究circRNA在口腔鳞状细胞癌发病机制中的机理研究奠定前期基础。

1 资料和方法
1.1 研究对象

选取2016年1月— 2016年10月在南昌大学附属口腔医院口腔颌面外科收治的口腔鳞状细胞癌患者48例, 其中男性32例, 女性16例, 年龄37~72岁, 中位年龄55岁, 舌癌20例, 牙龈癌13例, 颊黏膜癌8例, 唇癌4例, 腭癌3例; 依据TNM分期, 分为Ⅰ +Ⅱ 期组30例和Ⅲ +Ⅳ 期组18例; 伴淋巴结转移者12例, 无淋巴结转移者36例, 低分化9例, 中、高分化39例。口腔鳞状细胞癌患者术前均未进行过放疗、化疗、中西医结合治疗及生物治疗, 且无合并其他肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病等。手术切取口腔鳞状细胞癌组织及对应的手术切缘距肿瘤边缘2 cm的癌旁正常口腔黏膜组织(经组织病理切片确诊)作为标本, 离体后立即置于液氮保存。患者均签署知情同意书。从收集的48例样本中用随机数表法随机选取3例口腔鳞状细胞癌组织及相应癌旁组织(舌癌2例, 牙龈癌1例; Ⅰ +Ⅱ 期2例, Ⅲ +Ⅳ 期1例; 伴淋巴结转移者1例, 无淋巴结转移者2例; 低分化1例, 中、高分化2例), 利用美国Arraystar公司人circRNA V1.0版本芯片(Arraystar Circular RNA Microarray Aaary Version 1.0)检测这3例口腔鳞状细胞癌患者癌组织和配对癌旁组织中的差异表达circRNA, 采用RT-qPCR方法验证所筛选的部分circRNA分子在剩余45对口腔鳞状细胞癌组织与癌旁组织中的表达情况。

1.2 主要试剂和仪器

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司; PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex Taq™ 购自大连宝生物TaKaRa公司; PCR引物由上海生工生物工程技术有限公司合成; RNeasy Mini Kit购自德国Qiagen公司; Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司; 人circRNA芯片由美国Arraystar公司提供。

1.3 总RNA的提取和纯化

取液氮保存的口腔鳞状细胞癌组织及癌旁正常口腔黏膜组织标本, 在液氮中碾碎至粉状, 按Trizol试剂说明书提取口腔鳞状细胞癌癌组织和癌旁正常组织中的总RNA, 经焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)处理过的蒸馏水溶解, 采用RNA纯化试剂盒纯化总RNA。采用NanoDrop ND-1000分别检测样本在分光光度计230 nm、260 nm和280 nm的吸光度值, 计算RNA的总量和质量。

1.4 circRNA表达谱检测

根据试剂盒操作步骤, 将3例口腔鳞状细胞癌组织和相应癌旁对照组织中的总RNA用RNase R处理, 去除线性RNA分子, 然后采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA, 标记的cRNAs采用RNeasy Mini Kit进行纯化, 用Nano Drop ND-1000检测其Cy3标记特异活性和浓度。取1 μ g荧光标记的cRNA, 加入5 μ L 10 × Blocking Agent和1 μ L 25 × 裂解液, 混匀后, 60 ℃ 温育30 min, 然后加入25 μ L 2 × 杂交缓冲液。将50 μ l杂交反应液加入Human Circular RNA Array反应玻片上。65 ℃杂交反应17 h。反应结束, 洗片固定后, 在Agilent G2505C扫描仪上扫描。用Agilent Feature Extraction Software (version 11.0.1.1)软件对杂交图片进行分析并提取数据, 最后对数据进行标准化和分析, 寻找2组样本间差异表达的circRNA, 通过倍数变化(Fold Change)和P值进行筛选, 采用t检验方法, 选择差异倍数≥ 1.5, P< 0.05的circRNA作为差异circRNA。circRNA芯片检测由上海康成生物有限公司完成检测及数据初步分析。

1.5 RT-qPCR验证

根据芯片分析结果选出的差异表达circRNA分子中, 挑选6个差异变化明显的circRNA分子, 以β -actin作为内参, 采用SYBR Green法进行RT-qPCR验证。取1 μ g RNA, 按照PrimeScript反转录试剂盒说明书, 将RNA逆转录为cDNA。RT-qPCR反应体系为20 μ L, 引物序列见表1。反应体系包括:1 × SYBR Green I master-mix、0.5 μ mol/L特异正向引物、0.5 μ mol/L特异反向引物、1 μ L反转录产物。反应条件为:预变性95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 30 s, 40个循环, 通过熔解曲线检测PCR产物的特异性。RT-qPCR检测使用ABI 7500仪器进行。每孔均设3个复孔, 取平均Ct值作为该样本最后Ct值, 以β -actin基因作为内参基因, 计算2-△ △ Ct值反映circRNA的相对表达水平。

表1 RT-qPCR引物序列 Table 1 Primer sequence for RT-qPCR
1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析, 经Kolmogorov-Smirnov检验数据呈正态分布, 结果以均数 ± 标准差表示, 两样本均数比较用t检验, P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果
2.1 样本总RNA和标记cRNA的质量检测

经分光光度计检测, 口腔鳞状细胞癌癌旁对照组织和口腔鳞状细胞癌癌组织样本RNA的A260/280值均为1.8~2.0, 说明总RNA具有较高的纯度, 样本提取RNA总量均≥ 0.5 μ g, 均达到质检标准, 符合检测要求(表2)。每份样本采用荧光染料标记, 标记RNA总量均≥ 1.65 μ g, Cy3标记特异活性均≥ 9 pmol Cy3/μ g, 符合实验要求, 可用于后续芯片杂交。

表2 总RNA和合成标记cRNA的质控 Table 2 Quality assurance of total RNA and cRNA quantification
2.2 芯片结果分析

选择相对表达量比值在1.5倍以上, 且差异具有统计学意义(P < 0.05)的circRNA作为表达差异的circRNA。芯片检测结果显示, 与癌旁对照组织相比较, 口腔鳞状细胞癌组织中相对表达量比值在1.5倍以上变化的circRNA有155条, 其中上调45条, 下调110条(图1)。统计分析后筛选表达上调和下调的前15位circRNA(表3表4), 其中hsa_circ_0001874是上调倍数最大的circRNA, 上调倍数为6.23; hsa_circ_0000520是下调倍数最大的circRNA, 下调倍数为8.17。

表3 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织相比有显著上调的前15个circRNA Table 3 Top 15 up-regulated expressed circRNAs between OSCC tissues and matched adjacent tissues
表4 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织相比有显著下调的前15个circRNA Table 4 Top 15 down-regulated expressed circRNAs between OSCC tissues and matched adjacent tissues

图1 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁对照组织之间差异表达的circRNA
a: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织circRNA芯片聚类分析图, T1~T3为口腔鳞状细胞癌组织, N1~N3为癌旁对照组织; b: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织circRNA表达强度箱形图; c: 口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织差异表达circRNA散点图, T为口腔鳞状细胞癌组织, N为癌旁对照组织。
Figure 1 Analysis of differentially expressed circRNAs in OSCC tumor and matched adjacent tissues

2.3 RT-qPCR对部分circRNA进行验证

笔者挑选口腔鳞状细胞癌癌组织上调差异表达最显著的3条circRNA(hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971和has_circ_0067934)和下调差异表达最显著的3条circRNA(hsa_circ_0000520、hsa_circ_0023944和hsa_circ_0000140)在45对口腔鳞状细胞癌组织与癌旁组织中进行RT-qPCR验证。结果显示, 口腔鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0001874、hsa_circ_0001971和has_circ_0067934的表达明显上调, 同时hsa_circ_0000520、hsa_circ_0023944和hsa_circ_0000140的表达明显下调, 与芯片数据趋势基本一致(表5)。

表5 RT-qPCR检测差异性表达的circRNA表达量 Table 5 RT-qPCR validation of some differentially expressed circRNA n = 45, $\overline{x}$± s
2.4 Hsa_circ_0001874表达水平与口腔鳞状细胞癌临床病理特征的关系

在上述芯片筛选的口腔鳞状细胞癌组织特征circRNA表达谱中, hsa_circ_0001874上调表达最明显, 本研究进一步将口腔鳞状细胞癌患者按临床病理参数进行分组, 分析患者肿瘤组织hsa_circ_0001874表达水平与性别、年龄、肿瘤部位病理、大小、临床分期、分化程度及颈淋巴结是否转移的关系。结果显示, hsa_circ_0001874的表达在不同临床分期及细胞分化程度存在显著差异, TNM Ⅲ + Ⅳ 期患者的hsa_circ_0001874表达水平(6.67 ± 1.71)明显高于TNMⅠ +Ⅱ 期患者(3.74 ± 1.44)(t=6.11, P < 0.05); 低分化组的hsa_circ_0001874表达水平(7.25 ± 1.20)要明显高于中、高分化组(4.33 ± 1.87)(t=4.42, P < 0.05)。hsa_circ_0001874在不同性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及淋巴结转移情况等各组间的表达差异无统计学意义(P> 0.05)。

2.5 Hsa_circ_0001874相互作用miRNAs的生物信息学分析

采用Arraystar公司circRNA靶基因分析软件, 预测可能与hsa_circ_0001874相互作用的靶miRNA分子。结果如图2所示, 发现miR-103a-3p、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的潜在靶基因。

图2 Hsa_circ_0001874与miRNAs相互作用位点的详细注释图Figure 2 A snippet of the detailed annotation for hsa_circ_0001874/miRNAs interaction

3 讨 论

circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA, 通常由前体mRNA(pre-mRNA)经可变剪切产生, 具有闭合环状结构[8, 9]。近年大量研究证实, circRNA在多种人类肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的调控作用[10]。Yang等[11]研究发现circ-Amotl1能够通过诱导c-Myc入核促进肿瘤生成。Zhu等[12]研究发现circ-BANP在结肠癌中表达上调, 并与患者预后相关, 敲低circ-BANP可明显影响结肠癌细胞的增殖。在胃癌研究中发现hsa_circ_002059显著下调, 经证实其表达水平与胃癌的远处转移、TNM分期、性别、年龄均相关[13]。以上研究表明, 某些特定的circRNA在肿瘤的恶性进展中发挥着重要的作用。

与其他恶性肿瘤一样, 口腔鳞状细胞癌的发生发展也是由编码和非编码基因共同参与的一系列复杂的细胞生物学过程[14]。最近, circRNA在口腔鳞状细胞癌中的调控作用也开始引起人们的关注。Chen等[15]研究发现circRNA_100290可通过内源竞争结合miR-29, 从而解除miR-29对CDK6的抑制, 促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖。目前, circRNA在口腔鳞状细胞癌中的研究刚起步, 仍有必要继续寻找口腔鳞状细胞癌特异性表达的circRNA。本研究通过高通量circRNA芯片技术筛查口腔鳞状细胞癌患者癌组织中差异表达的circRNA, 结果与癌旁对照组织进行比较, 发现口腔鳞状细胞癌癌组织中相对表达量比值在1.5倍以上变化的circRNA有155条, 1.5倍以上上调的circRNA共45条, 1.5倍以上下调的circRNA共110条。RT-qPCR验证的结果与circRNA芯片检测结果一致, 表明芯片数据的可靠性。本研究不仅鉴定出已报道的has_circ_0067934[16]和hsa_circ_0000520[17], 亦筛选出多个未见报道的差异表达circRNA, 如hsa_circ_0001874等, 本研究进一步发现hsa_circ_0001874的表达水平与肿瘤临床分期及分化程度相关, 分化低的口腔鳞状细胞癌组织中hsa_circ_0001874表达水平明显高于中、高分化的口腔鳞状细胞癌组织; TNM分期Ⅲ /Ⅳ 期口腔鳞状细胞癌组织的hsa_circ_0001874表达水平明显高于Ⅰ /Ⅱ 期的标本。

已有研究表明, circRNA作为一种新型竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA), 具有miRNA海绵作用, 能够通过与miRNA相互作用, 导致miRNA及其靶基因表达失调, 进而参与癌症进程[18]。Zhong等[19]研究发现, circRNA MYLK可作为ceRNA竞争抑制miR-29a活性, 上调miR-29a靶基因VEGFA的表达, 并导致EMT及Ras/ERK信号通路的激活, 促进膀胱癌发生发展。Li等[20]研究发现, circHIPK3可作为ceRNA竞争抑制miR-558活性, 从而解除对其靶基因乙酰肝素酶的抑制, 影响膀胱癌细胞的增殖与转移。本研究发现, hsa_circ_0001874在口腔鳞状细胞癌组织中显著高表达, 可能参与了口腔鳞状细胞癌发生发展过程, 笔者采用Arraystar公司circRNA靶基因分析软件, 预测hsa_circ_0001874的潜在靶miRNA分子, 发现miR-103a-3p、miR-107、miR-593-5p、miR-661和miR-662可能是hsa_circ_0001874的潜在靶基因。已有研究表明miR-103a-3p和miR-107在多种实体肿瘤中异常表达, 其异常表达与肿瘤的发生发展密切相关, 并可作为判断不良预后的分子指标[21]。在后续研究中将通过分子生物学实验进一步研究hsa_circ_0001874对口腔鳞状细胞癌的调控机制, 探讨这些circRNA对口腔鳞状细胞癌发生发展的调节作用及其机制, 以期为口腔鳞状细胞癌的临床治疗提供新思路。

The authors have declared that no competing interests exist.

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